自动化化学平台优化快速流动肽合成（即AFPS）

蛋白质的生产是学术界和工业界研究的重要组成部份，可以通过生物学技巧或物理合成来完成。大多数蛋白质是通过生物抒发斩获的，该过程巨大程度上限制了其物理组成到典型的蛋白原多肽上。遗传密码扩充前进已准许在天然蛋白质的结构中掺入多达两个非天然谷氨酸。相比之下，当须要整合多个非天然谷氨酸，翻译后修饰或人工骨架时，物理合成可提供无与伦比的灵活性。合成蛋白早已可以使用通过液相和带环技巧的结合。因此，蛋白质的总体物理合成仍保持高度劳动密集型。

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【研究成果】

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因为无效的偶联和副反应，长约50个组氨酸均质肽的液相肽合成仍然是常年的挑战。日前，月刊刊载了由麻省工科大学和博士团队最新成果。它们使用手动化物理平台优化迅速流动肽合成（即AFPS，优化传统的液相态肽合成（SPPS）），并才能形成完全合成的单结构域蛋白。 #

他们报告了高效的物理反应，以及与手动迅速流动仪器相匹配的物理物质，可直接制造历时327个连续反应的164个组氨酸肽链。机器运行快速：数小时内完成肽链的延展。它们通过物理合成九种代表酶，结构单位和调节因子的不同蛋白质链来证明该办法的实用性。制备和折叠后，合成材料显示出与生物抒发蛋白质相当的生物化学和酶促性。高保真手动流动物理是生产无内质网体的单域蛋白的取代方式。相关链接发表在：DOI:10.1126/. #

【图文解读】1.迅速筛选适于AFPS方案开发的反应变量 #

这篇文章报告了一个常规方案，该方案容许逐渐物理合成厚度少于50个多肽的肽链，每位多肽的循环时间约为2.5分钟（图1（A））。优化方案推行在通过AFPS系统获取的剖析数据集合的基础上蛋白质的生物合成，可提供高保真度和前辈性含量的产品。使用该方案，可以在3.5至6.5小时内合成从芽孢球菌RNA酶抑止剂（90个组氨酸）到分选酶A59-206（分选酶A*，164个组氨酸）的单域蛋白链。为了证明功能蛋白的形成，将这种序列折叠，并确定了他们的生物地理特征和酶活性。物理蛋白质合成的时间尺度与重组抒发的时6间尺度相等，所以为生物物理方式提供了一种实用的取代方式，同时开辟了超过规范多肽的物理空间。 #

作者首先优化了常规参数，包括流速，反应丙酮，试剂含量，气温和偶联剂（图1B）。研究了不同活化剂在偶联方法中的功耗。还筛选了体温，时间和活化剂以及不同的手性保护羧基的影响（图1C和D）。对于这两种谷氨酸，差向异构体随激活时间和体温而提高。事实证明，保护羧基的选择对于氨基酸至关重要。接着，作者确定了在某些优化条件下差向异构化作用的数目不会在多个偶联循环中提高（图1E）。

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图1.手动迅速流动液相肽合成的优化条件可实现长多肽序列的高保真度生产。

2.优化的AFPS优于传统的合成方式 #

作者继续调查了优化的AFPS条件是否可以用胰岛原（86个组氨酸）和人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）蛋白酶（99个组氨酸）作为检测序列来推动更长序列的合成。使用它们标准的AFPS方案，胰岛原和HIV-1蛋白酶的合成分别在3.5和4.5小时内完成。高效气相色谱(HPLC)制备形成2.2mg（1％）的制备胰岛原和5.3mg（1％）的制备HIV-1蛋白酶。在温度，70°C和90°C的商用合成器上进行AFPS和标准一批次的SPPS合成之间的比较阐明，优化的AFPS方案的合成疗效得到了显着缓解（图2）。

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图2.胰岛原和HIV-1蛋白酶的合成证明了AFPS优于传统SPPS方式的优势。

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3.折叠的合成蛋白结构和功能与重组样品相当

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物理变性可适于评估合成蛋白的结构完整性和稳定性。球形蛋白芽孢球菌RNA酶（从解淀粉芽孢弧菌分离自真菌内质网核苷酸酶（RNase））是一个以研究蛋白质折叠，变性，并结合其抑止蛋白芽孢球菌RNA酶抑止剂模型系统（图4A）。通过气相层析串联质谱(LC-MS)和HPLC方式难以分辨合成和重组白芽孢球菌RNA酶的一级结构（图4B）。使用物理变性萤光测量法作为五级结构完整性的读数器（图4C）。 #

图4.合成的芽孢球菌RNA酶抑止剂和芽孢球菌RNA酶抑止剂折叠成天然五级结构蛋白质的生物合成，并显示出与重组样品相当的酶活性。 #

HIV-1蛋白酶的一级结构通过LC-MS和HPLC方式确认（图5B）。HIV-1蛋白酶酯化HIV的肽，使用萤光肽可以量化其蛋白酯化活性。合成的HIV-1蛋白酶的米氏常数（）为KM=20.9±1.0μM，周转数kcat=29.6±4.1s-1，接近于相同文献中发表通过SPPS荣获合成样品的数值（图5C）。将合成模型配体肽蛋白酶孵卵，可形成类似野生型的在单个Phe-Pro位点上进行独有分裂的特异性（图5D）。

图5.包含三个非规范谷氨酸的合成HIV-1蛋白酶折叠成天然二聚体结构，并显示出与文献样品相当的酶促活性和配体特异性。 #

【陈述小结】

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经过优化的AFPS方案证明了流动物理优于常规一批处理的方式，所形成的肽链比常规标准SPPS可荣获的肽链长三倍以上。通过在可再现的反应装置中迅速筛选变量，实现了对现有步骤方案的改进。自施行AFPS以来，作者早已生产了5000多种肽，并手动搜集了所有合成的在线剖析数据。展望未来，可以通过机器学习和其他估算方式来运用这一广泛的高品质数据集来逐步缓解步骤中的肽合成。强悍而广泛使用的常规物理生产蛋白质的方式有望对物理生物学和新疗法的发展形成重大影响。最后，AFPS具备按需按量生产的潜力，并或许拯救生命的个性化抗生素，比如用酶取代疗法或新抗体的疾病卡介苗。

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