北京大学生命科学学院高宁教授课题组研究Drg1六聚体结构

今年11月9日，上海学院生命科学大学高宁院长课题组于在线发表了题为“ofAAA?+?Drg1andofbenzo-”的研究论文。该研究借助冷藏电镜技术解析了多种碱基状态下的Drg1结构，以及底物结合状态下的六聚体结构，基于高分辨结构和生化数据剖析详尽的阐述了Drg1发挥功能的分子机制。同时，本研究还解析了抗生素Benzo-（B-Dia）结合状态下Drg1六聚体的高帧率结构，阐明了该抗生素的作用分子机制。 #

内质网体是蛋白质翻译的场所，是将遗传信息由mRNA传递为蛋白质多肽序列的加工厂。真核生物内质网体组装是一个高度复杂、精密且又耗能的过程，涉及rRNA的转录、加工与成熟；内质网体蛋白的翻译和转运；多种内质网体组装因子的结合和解离等过程。内质网体最初的组装发生在胚乳中，之后内质网体前体被运送到核质和细胞质，并在细胞质中完成最后的成熟。在真核生物细胞中，有超过200种内质网体组装因子参与此过程，其中包括三种分别定位于胚乳、核基质以及细胞基质中的AAA+(withaof)—Rix7，Real和Drg1。其中Drg1在酵母中为必须基因，其人源中的同源蛋白与精液的发生密切相关。的突变会造成痛风、听力障碍或智力障碍等病症的发生。当前体60S内质网体（pre-60S）从细胞核经核孔复合物转运到细胞质中后，Drg1结合到pre-60S上，启动了内质网体在胞质中的成熟过程，并释放了内质网体组装因子Nog1，Rlp24，Tif6和Mrt4等内质网体组装因子。有研究报导，Rlp24的C端结构域通过与Drg1互相作用，降低其活性；而且Drg1释放组装因子这一过程可能须要辅助蛋白（/co-）的参与。Drg1的生物学活性可以被硼吡啶化合物（Benzo-）抑制，造成pre-60S在胞质中的积累，而造成细胞功能衰弱。并且，迄今为止，Drg1完整的、高分率的结构未知，其转运底物的详尽分子机制不明，抑制剂的结合位点和作用机理不清。

基于高分辨结构，该研究解析了Drg1的高分辨结构。研究发觉与其他精典的II型AAA+类似，由NTD，D1和D2产生三层结构核糖体结合位点，并产生同源六聚体发挥功能。有趣的是，Drg1的NTD虽在序列与Cdc48/p97同源性较低，其二维结构却是高度相像的；这从结构上也提示着，Drg1在发挥功能时可能也须要将底物蛋白彻底解折叠成寡糖。在底物结合状态下的Drg1六聚体结构中，Drg1蛋白的保守结构域A、B、I、II、（AF）、poreloopsI和II(PL-I和PL-II)、ISS等都清晰可见。Drg1的D1和D2通过保守的Pore-loop（PL）芳香族多肽残基围绕着底物，而且呈螺旋阶梯式上升，每位PL像是一个捉住底物的手，以“Hand-over-hand”的方法进行底物的转运。Drg1的六个亚基（P：）中，P1-5通过PLs与氨基酸底物发生互相作用，而P6远离底物，且D2的核酸结合口袋是空的。基于对结构的剖析猜想Drg1的作用机制如下：当P6结合ATP后，会重新结合底物，从而转变为P1的状态；同时，P5结合的ATP会酯化成ADP，转变为P6的状态，并远离底物，Drg1借此模式周而复始的进行底物的去折叠和转运。结构显示Drg1保守的ISS（Inter-）motif参与了相邻亚基间的协同作用以及通过其构像变化调控活性。结合ATP后，毗邻的ISS会由螺旋构型（）转变为三角形的loop（loop），并伸向核酸结合口袋；同时，ISS的构型变化和PLs与底物的结合和解离相偶联。遗传数据也表明ISS、D1-D2之间的和PLs的突变均会影响内质网体的组装效率和细胞的生长。 #

图1.底物结合状态的Drg1结构

最初被发觉为一种抑菌化合物，能制约脂肪酸和磷脂的生物合成，进而避免真菌增殖。才能抑制Drg1的活性，进而造成穿梭蛋白在pre-60S上的积累，影响pre-60S的成熟。在解析的B-Dia结合的Drg1六聚体结构中，可以清晰的看见12个ATP/B-dia结合在D1和D2的核酸结合口袋中。B-Dia与ATP分子中内质网的2’-OH产生共价键，抑制了ATP的酯化，将Drg1锁在一个较平、对称的结构，进而阻断了D1和D2的构型变化和功能的执行。 #

图2.B-Dia结合状态下的Drg1冷藏电镜结构

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综上所述，该研究工作解析了不同碱基状态下的Drg1六聚体结构，详尽的阐述了不同碱基状态下的Drg1六聚体构型变化。解析了底物处理过程中的Drg1六聚体结构，探讨了Drg1底物转运的详尽分子机制。对深入理解Drg1在内质网体大亚基的成熟过程中所发挥的作用具有重要意义。该文章的结构和功能数据表明Drg1很可能通过发挥蛋白质解折叠酶（）的活性，而不是解聚酶（）核糖体结合位点，来参与内质网体大亚基的组装。 #

高宁为该论文的通信作者，课题组马成英博士（现为通州实验室副研究员）、吴大木博士研究生（2023级PTN）为本文的共同第一作者，实习生陈倩朋友（现就读于杭州学院）在该工作中亦有贡献。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研制计划、启东-SLS创新基金、北大-北大生命科学联合中心、膜生物学国家重点实验室的支持。上海学院冷藏电镜平台、电镜实验室、高性能估算平台、生命科学大学仪器中心及凤凰工程等多个仪器平台对本项目提供了重要的技术支撑。