转录组测序在原核生物分子机制研究中的具体应用

易点评

为了阐明原核生物奇特的分子机制，转录测序目前早已成为原核生物分子机制研究领域的神器，通过转录组学探求环境胁迫、抗菌抗生素等对原核生物的影响机制在近些年来已成为了一种普遍的研究方式。对原核生物的转录组研究最早应用于致病菌。下边这篇文章就是转录组测序在致病菌研究中的具体应用。文中的抑菌肽是一种很有前途的抗多药耐药性的取代抗生素。而DP7是一种人工设计的抑菌肽，具有低毒的抑菌活性和免疫调节作用。作者探究了DP7对多药耐药的铜绿假单胞菌的抑菌活性，以及其对生物膜感染的抗性，并借助转录组测序等方式初步阐述了其可能的抑菌机制。

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研究背景 #

对药物形成耐药性是人类健康最大的恐吓之一，目前，每年起码有700千人死于抗菌素耐药性(AMR)，并且病原菌在宿主体内的破坏了生物膜正常状态推动了AMR并造成严重的慢性感染，因而临床上急迫须要开发出新型抗耐药抗生素和与生物膜相关的抗感染抗生素。

抑菌肽DP7()是一种低毒抗革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的抑菌肽，具有较低的细胞毒性和天然免疫激活能力，并与万古霉素和阿奇霉素具有协同作用，是目前最有希望取代药物的抑菌肽之一。本文研究了抑菌肽DP7对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌活性。结果表明，抑菌肽与万古霉素和阿奇霉素具有协同作用，具有较强的天然免疫激活能力，可有效抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性病原菌的感染。 #

在这种病支原体中，铜绿假单胞菌是一种普遍存在的革兰氏阳性致病菌，因为其多样的表型和代谢模式，已成为临床感染最常见的致病菌之一。一旦铜绿假单胞菌入侵生物膜构建慢性感染，它都会经历一系列的适应过程，使MDR进一步复杂化，使原先难治的感染演弄成恐吓生命的病症，非常是在患有遗传性癌症、囊性纤维化和其他免疫缺陷的病人中。但是，据我们所知，DP7抗铜绿假单胞菌感染的活性及其机制仍未被研究过。 #

本研究对DP7的抗铜绿假单胞菌活性进行了系统的研究，包括： #

研究结果 #

DP7对耐药铜绿假单胞菌显示出抑菌活性 #

表1显示了铜绿假单胞菌的药敏结果(MIC值)。在104株临床分离菌种中，24株对药物敏感，19株对一种抗生素耐药，4株对两种抗生素耐药，57株多药耐药(对三种或三种以上药物耐药)。

DP7在临床哮喘诊治中的最低抗菌含量(MIC值)。铜绿假单胞菌的MIC值为8~32mg/L，对PAO1、PA14和PAO1的MIC值为16mg/L。值得注意的是，仅有6株(6/104，约5.8%)DP7的MIC达到最高(32mg/L)，其中约15.8%(3/19)为单耐药菌种，约5.3%(3/57)为多药耐药菌种。敏感株和耐药株对DP7的敏感性无显著差别(最常见的MIC值为16mg/L)，表明DP7对多药耐药铜绿假单胞菌具有低毒抑菌活性。时间-杀灭曲线表明，DP7的抑菌疗效与其他常用药物不同。 #

DP7具有生物膜抑制活性达到抗原外铜绿假单胞菌的作用 #

体外抑菌活性测定表明，在64mg/LDP7含量下，PAO1、DP7R、PA14和PAO1的生物膜生物量分别增长了43%、52%、68%和51%(图1)。对于WTPAO1，随着DP7含量的逐步降低，生物膜中的活细胞数没有明显变化，而生物膜生物量的降低却表现出对DP7含量的依赖性，表明DP7可能通过靶点特定的生物膜相关靶向而不是简单地杀灭病菌来抑制生物膜的产生。同时，对于高毒力菌种PA14，随着DP7含量的降低，生物膜和底栖状态下的活细胞数日渐降低，表明DP7对PA14具有有效的抗生物膜活性。值得注意的是，突变弧菌和的生物膜生物量没有表现出对DP7的含量依赖性效应，但在高含量DP7作用下，生物膜中的活细胞数目降低。真菌细胞被生物膜中的胞外聚合物(EPSS)包裹和保护，是引起慢性感染性疾患对抗菌素医治形成抵抗的主要诱因。

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图1 #

DP7的抗菌和抗生物膜活性

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在急性感染中，DP7对PAO1感染的大鼠有显著的保护作用，在0.25、0.5和1mg/kg剂量下，分别有30%、70%和50%的存活率(图2b)，同时不会造成显著的体重变化(图2a)。0.5mg/kgDP7与20mg/kg氨曲南形成作用相当。 #

在慢性生物膜感染的案例中，施加0.5mg/kgDP7组的肺部真菌负荷控制在1%×/肺，而阳性对照组为1%×/肺(图2c)。在组织学检测中，PBS对照组可见严重的痤疮结构损伤，包括但不限于胃壁黏液渗出降低、上皮细胞排列衰弱、红细胞浸润和严重的肺脏肿胀，用DP7或氨曲南医治组的肺组织结构未见显著损伤。值得注意的是，在DP7处理的大鼠中有更多的中性粒细胞集聚(图2d)。综上所述，DP7在铜绿假单胞菌慢性生物膜感染中具有一定的抑菌活性。 #

图2

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DP7处理的PAO1转录剖析 #

RNA-Seq剖析显示，在DP7处理的PAO1中共有532个DEG，其中235个上调基因，297个下调基因。KEGG富集剖析显示明显差别抒发基因的主要功能涉及能量代谢、翻译和免疫系统，(图3a)。对44个上调的DEG和106个下调的DEG进行剖析，发觉共372个互相作用。代谢剖析表明，DEG主要干扰III型分泌系统(III型SS)、生物聚合物运输、NADH代谢、ATP合成、翻译和LPS的生物合成及运输(图3b)。考虑到膜结构衰弱可能是DP7抗金红色猕猴桃杆菌的作用，作者在前期工作中选择了参与LPS生物合成和膜脂蛋白抒发的4个基因，即exbD1、blc、fpvR和oprL。其中exbD1、blc和fpvR基因分别降低0.55、0.60和0.53(图3c)。exbD1和blc的抒发结果与RNA-Seq一致。 #

图3 #

抗DP7的PAO1弧菌DP7R的基因组序列剖析 #

经过6个月的抗性筛选试验，获得了具有DP7抗性PAO1弧菌DP7R(MIC=128mg/L)。检查到DP7R的7个SNP(表2)，并经测序验证，它们影响以下基因/蛋白：mexE、、pmrB、wapG和wbpJ和。这种结果表明，在对DP7的适应性抗性培养中，这种突变参与了抗生素外排泵激活、LPS生物合成、膜蛋白和毒力作用等途径，这与RNA-Seq确定的干扰DP7的DEG是一致的。 #

DP7对细胞形态学的影响

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通过电镜观察DP7对细胞形态的影响。在TEM剖析中(图4)，未经处理的PAO1细胞显示出一个厚厚的、均匀的、略微透明的细胞壁，细胞中有中等大小的致密颗粒(图4a)。相反，抗DP7的PAO1菌种DP7R的细胞壁较厚，电子萤光边界模糊且较重(图4b)。经0.5%MIC(8mg/L，图4c)和1%MIC(16mg/L，图4d)DP7孵育1h后，PAO1的细胞壁出现不同程度的裂解和褶皱，胞质显著异常，部份细胞内膜和外膜完全消失。PAO1经1%MIC(128mg/L)HH2处理1h后也出现类似的现象。另外，在16mg/LDP7作用下，DP7R细胞形态完整，未见细胞溶化或结构异常细菌是原核生物吗，这与本研究中DP7或HH2处理的金白色猕猴桃杆菌细胞凸出增厚，而DP7或HH2处理的金白色猕猴桃杆菌细胞壁出现节理和细胞溶化的透射电镜观察结果一致，说明DP7对金红色猕猴桃杆菌的细胞壁结构有进一步的靶点作用，即与DP7R株基因组测序中RNA-Seq和LPS相关SNP中LPS和外膜蛋白相关基因的上调是一致的。

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图4 #

PAO1弧菌DP7R、和的表型特点

依据对DP7处理弧菌的RNA-Seq、SNP和细胞壁观察的结果，作者推断DP7的一个可能的抑菌靶向是细胞壁外膜中的LPS。为了验证这些可能性，在建立了生长速率高于WTPAO1(图5b)的抗DP7的PAO1弧菌DP7R(图5a)后，作者企图对wbpJ、pmrB、wapG和GSHA基因中的四个相关SNP进行点突变(表2)。最后，成功建立了wbpJ(G139A)和GSHA(A44C)基因点突变的菌种和。

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表型特点包括生物膜生物量和活细胞数、LPS产值、PCA产值和运动能力。不出所料，弧菌DP7R、和的LPS产值分别比WTPAO1增加了36.0%、17.2%和33.9%(图5c)。相比之下，弧菌和的PCA产值分别是WTPAO1的3.18倍和3.50倍，而DP7R和WTPAO1的PCA产值差别不明显(图5d)。DP7R、、和WTPAO1的运动能力无显著差别，而DP7R和的游动和成群运动能力显著不足，表现为菌落半径变小细菌是原核生物吗，没有扩张的不规则分枝模式，而的游动能力得到部份维持。

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图5

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虽然存在运动缺陷，但突变体和的PCA降低可能有助于DP7对其生物膜生物量的非含量依赖性。其实DP7在生物膜中具有耐药性，但这两个突变体在底栖状态下对DP7仍表现出抗生素敏感性(MIC=16mg/L，与WTPAO1相同)。令人吃惊的是，随着DP7含量的降低，PEG生物膜中的活细胞数目明显降低(图2b)。这种结果表明，铜绿假单胞菌的LPS可能是DP7的一个潜在靶向，由于它抑制了LPS相关的基因，增加了、和DP7R中LPS相关的SNP抒发，并引起了电镜观察下细胞壁的破坏。作者的研究表明，DP7在急性和生物膜慢性病大鼠模型中对多药耐药铜绿假单胞菌和相关感染都有有效的抑菌活性，并为DP7可能参与干扰外膜LPS的MOA提供了研究思路。 #

研究推论 #

作者的研究工作证明了DP7是一种有效的抗耐药铜绿假单胞菌和生物膜相关慢性感染的抑菌剂，并概述了DP7可能的抑菌机制是通过与外膜上的LPS互相作用来实现的。作者的工作表明DP7可能是医治耐多药铜绿假单胞菌和生物被膜相关慢性感染的一种有前途的候选抗生素。 #

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市场部撰稿 #

市场部审稿