乳酸菌分离和单酶切电泳植物乳杆菌LP3的质粒提取液

乳酸菌在自然环境中广泛存在，在人类肠道道健康中发挥着重要作用。乳酸菌可以增进人体肠道道对乳糖的消化吸收，降低肠道功能失调，提高细胞免疫力，有助于防治结肠炎，与人类饮食和健康息息相关。是现代乳品、医疗药业、农牧等行业中具备重要经济价值的益生菌。

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多数乳酸球菌携带有数个引物，大小不一，其中多数引物为隐蔽性质粒，少数引物具备某种特殊功能。现在，已有许多乳链球菌引物被测序，并适于建立引物载体。国外举办的乳酸菌天然引物的分离及功能剖析的研究较少，造成运用基因安装工程方式对乳酸链球菌的改良遭到严重限制。因为乳酸菌是食品级的益生菌，其携带的引物只是食品级的，不存在乳品安全问题。 #

然而，华北林业学院兽医学校的方来杉、黄毓茂*和上海沃德生物技术有限公司的赖强等人对从口蘑中分离的动物乳链球菌LP3中的内源性质粒pLP3进行全序列测量及功能剖析，并运用该引物的复制子建立小肠球菌-乳酸菌穿梭引物D-pLP3，并研究该引物的寄主范围、转化效率和稳定性。在穿梭引物pLP3的基础上加上启动子PslpA和蓝色萤光蛋白（eGFP）基因，逐步建立乳酸菌抒发载体D-pLP3-PslpA-eGFP，并将其转换至动物乳链球菌，荣获萤光蛋白的抒发。该引物可为乳酸菌基因操作提供新的工具，为建立具备自主知识产权的乳酸链球菌的抒发载体提供基础资料。

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一、质粒分离和单酶切图谱

电泳结果显示动物乳链球菌LP3的引物提取液有3条带（图1），提示该菌种携带多个引物。其中一个引物大小在2kb左右，另外2个引物大小在15kb以上。将小引物（2kb左右）进行提纯回收，并命名为pLP3。对pLP3引物分别选用限制性内切酶EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI进行酶切剖析，最终发觉该引物经EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI酶切均荣获线性化引物，并且是惟一的线状引物DNA条带，不存在其他大小的DNA条带（图2）。 #

二、质粒序列的验证

打造的重组引物PUC-pLP3，在EcoRI酶切位点附近设计质粒pLP3-F/R，通过PCR验证所测序列是完整的（图3）。

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三、质粒注释和复制方法推定 #

3.1引物注释 #

pLP3引物是双链链状DNA分子，共2023bp，GC浓度为37.48%。BLAST比对结果显示：该引物的碱基序列与动物乳链球菌KLDS1.0801中的引物pLD1（2112bp，：.1）、（2140bp，：.1）最为相像，相同率分别为99%与98%。 #

通过开放阅读框（ORF）搜索，pLP3有7个ORF，ORF3编码一个含317个组氨酸残基的蛋白，坐落177888～18411130bp，应为pLP3引物的Rep蛋白，该Rep多肽序列与的同源性为100%，与动物乳链球菌的引物Rep蛋白（NCBI：.1、.1、.1等）的同源性均为99%，317个多肽中有1个组氨酸不同。ORF5编码一个含48个组氨酸残基的蛋白大肠杆菌图片显微镜，坐落515～661bp，其与动物乳链球菌（NCBI：.1）未知功能的假设蛋白相同性为100%。其余ORF在没有与之相匹配的蛋白。现在为止，因为引物pLP3除具备与复制相关的蛋白外，未发觉具备特定功能的蛋白质，所以引物pLP3应归为隐蔽性质粒。

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ORF3编码引物的Rep蛋白，在rep基因下游的10bp处有一段逆向重复序列，该序列是rep基因的转录中止讯号（），与引物rep基因的转录中止讯号序列一致。通过重复序列检索发觉pLP3引物的623～768bp有9个重复序列，该重复序列正向重复了9次，重复序列或许和引物的拷贝数有关。在rep基因上游的272bp处观察到典型的引物的复制双链起点（dso），该保守序列为5’-CGG-3’，与RCR引物pC194家族的dso同源。该引物的复制单链起点（sso）为ssoA类别，其保守序列为/T坐落489～494bp。 #

3.2引物复制方法推定 #

将比对完成的DNA序列进行注释，初步确定引物复制相关蛋白（图4）。用动物乳链球菌引物复制起始相关蛋白RepA和RepB与己发布的引物复制相关蛋白同源性制做系统发育树。

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由动物乳链球菌引物复制相关蛋白同源性的系统进化树可知，猜想pLP3引物属于动物乳链球菌编码Rep引物家族1。Rep-1蛋白家族引物和引物pC194的Rep均富含3个保守的，并且已被证明是pC194家族引物复制起始的关键。经过对pLP3引物序列剖析，发觉该引物的sso、dso位点以及Rep蛋白的与pC194家族的特性吻合。因而，推定pLP3的复制方法为滚环复制，属于pC194家族。 #

四、穿梭载体的建立及其寄主范围、转化效率和稳定性

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以克隆载体pUC19为模版，用质粒pUC19-F/R扩增pUC19引物上的小肠球菌复制子Ori的DNA片断。以引物为模版，用质粒CmR-F/R扩增引物上的阿莫西林抗性基因CmR花絮。用SOE-PCR将Ori花絮与CmR花絮连结构成OCR花絮，运用PshAI、NheI两个限制性内切酶将OCR花絮融合在pLP3引物载体上，将重组引物转换至小肠球菌DH5α感受态细胞，挑取转换子酶切验证得到正确的重组引物，命名为D-pLP3。 #

为确定穿梭引物D-pLP3的寄主范围，将穿梭引物电转换至各类乳酸菌感受态细胞内，并估算其在各类乳酸菌的转换效率和引物的稳定性。结果显示，穿梭引物D-pLP3均可在动物乳链球菌LP1和LP3、鼠李糖球菌R1等乳酸球菌和乳酸乳杆菌内成功电转，荣获相应的转换子。但在发酵乳链球菌G1、戊糖片杆菌ZQ4无法荣获重组引物的转换子。穿梭引物转换效率介于0.3×102～1.0×103CFU/μg（DNA品质计）之间，比普通的乳酸菌引物转换效率略低。

重组引物在动物乳链球菌LP1、LP3的寄主菌的遗失率约为30%，在乳酸乳杆菌中遗失率为37%。重组引物在鼠李糖球菌R1中经过60代连续传代培养后，重组引物遗失率几乎达到100%。重组引物D-pLP3在不同乳酸菌感受态细胞电转换效率和引物稳定性的差别，或许与引物不相容性有关。

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五、表达引物建立和萤光蛋白测试结果

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本试验设计3对质粒分别PCR扩增嗜酸乳链球菌S层蛋白的slpA启动子、Sig讯号肽、上的转录中止子，依据SOE-PCR的原理将3个外源基因抒发原件，克隆至穿梭引物D-pLP3，成功打造乳酸菌抒发引物D-pLP3-PslpA（图6）。根据eGFP蛋白能在蓝光的迸发下显示蓝色萤光的特点，所以，选eGFP蛋白作为抒发引物的靶标蛋白。 #

重组引物D-pLP3-PslpA-eGFP电转至动物乳链球菌，挑取转换后的阴性重组菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1和空载体D-pLP3-LP1接种于MRS液体培养基培养过夜，先取16h重组动物乳链球菌的菌体进行萤光显微镜观察，在蓝光迸发下，可以观察到白色萤光（图7）。之后取24h重组动物乳链球菌的抒发碱液，经60%硝酸铵沉淀后100倍浓缩，SDS-PAGE剖析。与空载体D-pLP3-LP1的重组菌相比较，重组菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1的培养滤液可见27kDa左右的目的条带（图8）。说明重组菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1已成功电转至动物乳链球菌LP1中，讯号肽Sig才能将eGFP蛋白成功分泌到胞外。 #

讨论 #

本研究从分离自传统发酵牛肉中的动物乳链球菌LP3中得到一个天然引物pLP3，该引物大小为2023bp，GC浓度为37.48%。逐步通过生物信息学剖析引物pLP3，该引物编码7个ORF，其中ORF3（317个组氨酸）为复制起始蛋白（RepA），ORF5（48个组氨酸）编码一个未知功能的蛋白。其余ORF在没有与之相匹配的蛋白，所以引物pLP3应归为隐蔽性质粒。按照Rep蛋白的同源性，及其该引物的sso、dso位点以及Rep蛋白的与pC194家族进行比较，发觉与pC194家族的特性相吻合，猜想该引物的复制模式为滚环复制，属于pC194家族。 #

本文《植物乳链球菌内源性质粒序列剖析及其抒发载体的建立》来始于《食品科学》2023年41卷4期118-124页大肠杆菌图片显微镜，作者：方来杉，赖强，钟泽民，黄毓茂。DOI:10.7506/-361。

为逐步推动鸟类源乳品科学的发展，推动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和增加生活质量，上海乳品科学研究院和美国乳品月刊社在成功举办“2023年植物源乳品科学与人类健康国际座谈会（上海）”的基础上，将与西藏中学农牧学校于2023年6月20-21日在成都共同举行“2023年植物源乳品科学与人类健康国际座谈会”。座谈会凑合肉、水产、禽蛋、乳制品等植物源乳品科学基础研究、现代化加工技术，储藏、保鲜及货运，品质安全与测量技术，营养及辣味成份剖析，副产物综合运用，法律、法规及发展新政等方面的重大理论研究展开深入思考，交流和借鉴国外经验，为广大乳品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。 #

在此，我们衷心的约请您现身本次国际座谈会，共聚人脉、共享资源、共谋发展！ #